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听老师将讲HPLC的计算

发布时间: 2021-12-10  点击次数: 1296次

                                                                 听老师将讲HPLC的计算

                                                           检硕科学器材(上海)有限公司

HPLC中涉及到计算的,主要是流动相配制和含量计算。RP-HPLC一般用缓冲盐配合甲醇乙腈作为流动相,计算主要涉及到如何配制流动相的问题。同时还要考虑到流动相配制的数量问题。HPLC计算主要运用外标法。内标法在HPLC分析中,运用不多。所以略讲。

1、流动相配制的计算

流动相在HPLC中起到运输样品的作用。而流动相准确地配制,在HPLC测试中有着重要的作用。准确地配制流动相能够保证测试中保留时间的重复性。所以,配制起来不能掉以轻心。

对于流动相配制,我把它概括为以下几个字。

计算,称量,溶解,调节,<混合>,过滤,脱气。为什么我把“混合"外加了个框呢?这就是涉及到你的设备是否是单元泵还是多元泵的问题了。如果只有一台单元泵,也无电磁阀切换功能的泵,需要混合这个步骤,而多元泵,或者低压梯度切换的,可以不需要所谓的混合。各走各的。

打个比方说,如果我的流动相是:甲醇:纯水=60:40(v/v),对于单元泵,那么只能甲醇和纯水混合,作为流动相,而多元泵或者多元梯度泵,则可以有两路,A路放甲醇, B路放纯水,A与B各比例控制为60%,和40%。

对于HPLC 配制流动相,要保证流动性配制准确,也要保证流动相配制足量,不多不少,这样保证在这批测试中,流动相不至于不够,也不致于太多而浪费,流动相一般需要在2-3天内用完。那么首先确定流动相要配制多少。举一个例子。

要分析30个样品,10个对照品,样品和对照品都分析2次。一个试样分析20分钟,流速为1.2ml/min。那么我要配制多少ml的流动相呢?通过计算来解决。(注:自动进样,连夜分析,可以设置停止泵程序)

一般来说,试样设置20分钟,还需要考虑进样的时间。假设进样时间为三分钟,那么一个试样所需要的时间为23分钟。我们可以计算:

根据计算,需要配制2208ml流动相。对于流动相,我们不能配制得太抠,需要考虑到吸滤头占的空间,那么我们再多配制个100-300ml,这取决于你的瓶底胖瘦。能够保证不被吸空为宜。那么我们就配制2500ml吧。

对于流动相如何配制,我们给一个实例

比如我要测试中药一清胶囊,我们翻阅中国药典,得以下信息。

一清颗粒是由黄连,大黄,黄芩(qin)组成。一般用于清热泻火解毒,化瘀凉血止血。用于火毒血热所导致的身热烦躁,目赤口疮,咽喉牙龈肿痛,大便秘结,吐血,咯血咽喉炎,扁桃体炎,牙龈炎等上述症候者。

其中黄芩主要成分黄芩苷用HPLC方法测试。先摘入如下:

色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(pH=2.7)(42:58 v/v)为流动相,检测波长为275nm。有效塔板数按黄芩苷峰计算不低于5000

我们看到,其流动相是:甲醇-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(pH=2.7)(42:58 v/v),那么也就是说有水相识0.2mol/L磷酸二氢钠溶液,其pH=2.7(用磷酸调节),有机相是甲醇。

要注意,对于HPLC用的试剂,水,溶剂,都是需要好的。试剂一般在分析纯以上。最好用优级纯,溶剂一般用HPLC级别。水用超纯水。所有的溶剂,溶液,都需要用0.45微米(或更细)的微孔滤膜滤过。也要保证溶剂瓶清洗干净。干燥。

流动相脱气是很重要的,现在一般的仪器都有在线脱气。当然,在配制流动相前脱气,亦重要。一般脱气又抽真空脱气,超声波脱气,吹He脱气,加热回流脱气等。常用的是前两个脱气方法。当然,抽真空脱气效率比较高,但是要注意有机相是否在抽真空后比例改变的问题。所以,对于混合两相的流动相,最好单独滤过,再混合。混合后一般会产生气体,用效率略低的超声波脱气即可。超声波脱气,只要看到无明显气泡即可使用。

二.含量计算

对于HPLC,我们一般使用外标法计算。那么有同学问,那么为什么内标法很少在HPLC上使用呢?

那么我们看下气相色谱和HPLC不同的进样方式。GC手动进样还是依靠进样针的定量进样,因为进样量很少,以微升计,所以,稍稍不留神,就有可能多进或者少进样。而且,进样针上的刻度也很粗,所以,GC用手动进样,使用外标法确实很考验测试者的娴熟技巧和过人的眼力。而内标法在GC进样测试中,由于内标物的调节作用,可以使得由于进样误差降低到最小,其相关的文章,查阅qinqingcao在本论坛的文章。但是HPLC进样是六通阀进样,其有一根定量环,如果手动进样能够保证定量环是充满样品溶液的,那么进样误差就几乎不存在。况且内标法需要寻找合适的内标物质,同时配制内标物,比较麻烦,所以在HPLC中很少听说用内标法定量计算。更多的,是使用外标法计算。

所以,HPLC手动进样一般使用3倍量的定量环进样。也就是说,20微升的定量环,我要注入60微升以上的样品溶液。保证定量环中充满着样品溶液。而多余的样品溶液会被排除。这样保证每次进样都是定量环中的那些量。对于定量环,这个体积一般也不是正好是20.00微升,但是我们保证进样过量(多余的溶液会被排出),则能够保证进样都是按照定量环中的体积进入色谱系统,这样消除进样的误差。对于定量环,在做完样品后需要用无溶质的流动相清洗数遍。如果定量环真的很脏,无法清洗了,那么可以裁剪一段管径和定量环相同的干净的不锈钢管,裁剪长度和定量管相同,安装上去。当然资金充裕的话,也可以购买厂家的定量环。

当然现在自动进样器很普及,那么使用自动进样器就更加方便了。

对于外标法,实际上也就是用已知浓度的对照品(标准品)来对样品中的该物质。这实际上很象砝码和天平。标准品就如同砝码,在同样的色谱条件下,标准品的峰面积和浓度已知,而样品中的峰面积可以测试出来,这样通过比例式子比较出样品中该物质的浓度了。

在这里,我想和大家说明的是,一般是通过保留时间做定性的。比方说,我测试维生素C,维生素C标准品在一定的色谱条件下,其保留时间为2.4分钟;样品在同样的色谱条件下,2.4分钟有峰,一般认为是样品中也许有维生素C。当然,保留时间定性确实有其局限,但是没有其他手段,那么保留时间还是能够发挥定性的作用。

对于定量,外标法定量,如果做的准确的话,需要用多点(浓度)定量。然而在企业用单点法定量还是很多的。对于做线性,精密度,回收率,这些内容我们在方法学验证中讲授,这里我还是着重讲解单点法校正。

在讲单点法校正,我先问同学们一个问题,如何用简单的方法来测试校园中的树高度?

通过一根已知高度的biao杆,在太阳下投射在地面的阴影的长度,计算出树的高度。同样道理,我们也是用已知的标准品的浓度和峰面积,用样品中同一物质的面积,计算出样品中的那个物质的浓度。根据稀释倍数计算出样品中,该物质的含量。

如果与标准曲线联系起来,这个就是单点法。也就是说,以0为圆心,标准品浓度和面积在二元坐标的一点的连线作为校准曲线。得y=ax 其中的a就是斜率,也就是面积随着浓度的变化而变化,其变化率为a。

那么样品浓度的计算,就是按照其峰面积在坐标上的点,对应的浓度。用以下公式计算。

单点法:

我们给出一个例题。

测试果汁中维生素C含量。配制20mg/100ml的维生素C作为标准品。称取20.005g果汁到50ml容量瓶中,加入流动相溶解定容摇匀。滤纸过滤。吸取滤液10ml到50ml容量瓶中。流动相定容摇匀。标准品和样品均吸取20μl进色谱,分别得到峰面积24336(标准品),20129(样品)。计算果汁中维生素C含量(mg/100g)

                                                                                                                                       本篇转载至液相色谱之家

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